1) 購買的限制性內(nèi)切酶帶有兩種不同的酶切緩沖液,該用哪一種? 每種限制性內(nèi)切酶帶有一管酶的zui適反應(yīng)液(通常是一種4-CORE反應(yīng)液),可能還帶有一只MULTI-CORE反應(yīng)液。 |
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2) 4-CORE酶切緩沖液體系是什么? 大多數(shù)(大約75%)Promega公司的限制性內(nèi)切酶有一種zui適酶切緩沖液,即4-CORE酶切緩沖液,分別叫作A、B、C和D。其余的25%的限制性內(nèi)切酶帶有一種特定的酶切緩沖液(酶切緩沖液E-L)。每一種限制性內(nèi)切酶帶有一只zui適酶切緩沖液。 |
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3) MULTI--CORE酶切緩沖液體系是什么? MULTI--CORE酶切緩沖液適用于雙酶切。每一種Promega公司的限制性內(nèi)切酶都測試了在MULTI--CORE酶切緩沖液中的活力,如果酶切活力達25%,就提供一只MULTI--CORE酶切緩沖液。作雙酶切時,如果兩個酶在MULTI--CORE酶切緩沖液中的活力達到50-100%,就可替代A-L酶切緩沖液。應(yīng)選用酶活力zui高的酶切緩沖液。 |
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4) 如何保存限制性內(nèi)切酶? 不太常用的限制性內(nèi)切酶多保存在-70oC,每周或每天用的酶保存在-20oC。有一些酶需要不同的保存條件。每一種Promega公司的限制性內(nèi)切酶都提供一份分析說明以供查訊。使用限制性內(nèi)切酶時,應(yīng)將酶保存在冰上。 |
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5) 一般的限制性內(nèi)切酶反應(yīng)中(也叫消化),應(yīng)用多少內(nèi)切酶? 所用的酶量取決于DNA的純度、量和型態(tài)。限制性內(nèi)切酶的活力單位定義為在適當(dāng)?shù)臏囟认?,?小時內(nèi),1ugDNA在50ul體積中,被*消化所需的限制性內(nèi)切酶的量。一般說來,線性DNA比超螺旋DNA更易消化。比如,酶切1uglambdaDNA,需要1-2單位的酶,而酶切1ug質(zhì)粒DNA,需要3-5單位的酶。 |
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6) 使用限制性內(nèi)切酶的一般步驟是什么? 一般步驟如下: A)測試酶切DNA的量 B)計算*酶切所需的酶量。為使終體積中甘油的濃度低于8%,計算能加的酶量,zui多能加終體積的10%(甘油的濃度為5%)。 C)10X反應(yīng)液的體積應(yīng)為終體積的1/10;10X反應(yīng)液的體積不應(yīng)小于酶的體積。 D)加入計算好的DNA,10X反應(yīng)液,酶。 加入水到終體積(20-50 ul),輕輕混勻,在適當(dāng)?shù)臏囟认卤?。一般酶的zui適溫度為37 oC,但有例外。應(yīng)查訊分析說明。 比如: 質(zhì)粒DNA (2ug/ ul) 5 ul 10X反應(yīng)液 5 ul 酶(5ug/ ul) 5 ul dH2O 35 ul 50 ul 37 oC保溫2-3小時。 應(yīng)zui后加酶。 |
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7) 一次使用兩個限制性內(nèi)切酶的一般步驟是什么(比如雙酶切)? 一次使用兩個限制性內(nèi)切酶的一般步驟,如同使用一個限制性內(nèi)切酶的一般步驟。但要注意兩個限制性內(nèi)切酶在同一種緩沖液中都要有活力。甘油的濃度不應(yīng)超過終體積的8%。應(yīng)注意有些酶對末端敏感,活力差。 |
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8) 能否在一次反應(yīng)中用很多的限制性內(nèi)切酶? 可以,一般而言,甘油濃度超過8%對酶切有抑制。有些酶在高的甘油濃度中會產(chǎn)生星活力。限制性內(nèi)切酶提供在50%的甘油中,故10 ul反應(yīng)體積中不應(yīng)加入超過1.6 ul的酶。 |
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9) 消化反應(yīng)中是否需要加牛血清白蛋白(BSA)? 不需要。酶切不需要加BSA。但Promega公司的限制性內(nèi)切酶活力測定時,均加入乙酰化的BSA達0.1mg/ml。BSA可以提高許多限制性內(nèi)切酶活力。Promega公司的限制性內(nèi)切酶均提供一管乙?;腂SA(R396D,E,F(xiàn)),并建議酶切時加入BSA達0.1mg/ml。 |
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10) 星活力是什么? 星活力是指在保溫條件改變,如NaCl過多存在于反應(yīng)液中,使酶切的核酸序列不同于它特定的識別序列。 |
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11) 什么是同切酶? 同切酶指兩個酶的識別位點和酶切位點相同,如 Sph I(CGTAC'G)和 Bbu I(CGTAC'G)互為同切酶。 |
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12) 什么是neoschizomer? Neoschizomer指兩個酶的識別序列相同,但酶切位點不同,如 Sma I(GGG'CCC)和 Xma I(G'GGCCC)互為neoschizomer。 |
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13) 基因組規(guī)格指的是什么? 基因組規(guī)格的酶適用于酶切包裹在瓊脂中的基因組DNA。另外,染色體DNA的制備、酶切和凝膠分離的條件對基因組規(guī)格的酶作了優(yōu)化。 |
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14) 如果一個限制性內(nèi)切酶不是基因組規(guī)格,是否表明它不能用于處理染色體DNA? 不一定。如果一個限制性內(nèi)切酶不是基因組規(guī)格,Promega公司沒有測試它能否處理包裹的基因組DNA。因此需作一些測試來決定酶是否會切割底物。 |
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15) 需要用多少單位的限制性內(nèi)切酶對瓊脂包裹的染色體DNA進行酶切? 切割包裹的DNA比普通底物需要更多的酶,一般需要多2倍。 |
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16) 什么是藍/白克隆測試? 藍/白克隆測試是一種確定酶切樣品中,存在的少量外切核酸酶活力的質(zhì)量檢查過程。通過測定一個功能基因(Beta-半乳糖苷酶)酶切和重新連接后,藍/白斑的比例,來確定外切核酸酶活力。如果存在少量外切核酸酶活力,或不存在外切核酸酶活力,得到的是藍色菌落。產(chǎn)生粘性末端的酶實驗產(chǎn)生的白色菌落應(yīng)小于2%,而產(chǎn)生平頭末端的酶實驗產(chǎn)生的白色菌落應(yīng)小于5%。這個方法的靈敏度很高,可以檢測出缺失一個堿基的酶切末端。 |
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17) 限制性內(nèi)切酶是如何命名的? 限制性內(nèi)切酶命名的次序如下: A) 用3個字母代表來源的生物(如 Bam 代表 Bacillus amyloliquefaciens ) B) 1個字母或阿拉伯?dāng)?shù)字代表菌株( Bam H) C) 1個羅馬字母代表發(fā)現(xiàn)或鑒定的次序( Bam HI) |
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18) 如何稀釋限制性內(nèi)切酶? 如果1小時內(nèi)會使用限制性內(nèi)切酶,可用補充有0.5mg/ml BSA的1X反應(yīng)液稀釋,如果在更長的時間內(nèi)才會使用限制性內(nèi)切酶,用酶貯存液稀釋。 |
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19) 如何查訊一種限制性內(nèi)切酶在特定條件下活力的資料? 請查尋 Restriction Enzyme Properties 。 |